... darum arbeiten wir in der Molekularpathologie Hand in Hand mit der Histologie, sowie Zytologie und führen die Untersuchung der dort diagnostizierten Tumoren weiter.
Hier beschäftigen wir uns mit Strukturen, die selbst mit dem Mikroskop nicht erkennbar sind.
Von unserem fachkundigen und qualifizierten Team bestehend aus BiologInnen und Technischen Assistentinnen werden in unserem Labor diese Methoden in Tumorgewebe, unter Mitarbeit von molekularpathologisch qualifizierten ÄrztInnen angewendet, mit dem Ziel der personalisierten Therapie:
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Sequenzuntersuchungen mittels Sanger-Sequenzierung oder NGS zur Analyse von Mutationen
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Methylierungsanalysen mittels Pyrosequenzierung
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Untersuchung von Hotspotmutationen in Tumoren bzw. Virusnachweise mittels MALDI-TOF
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in-situ Analysen zur Detektion von Translokationen, Bruchereignissen oder Amplifikationen in Tumorgewebe sowie EBV- und Leichtkettennachweise
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Genexpressionsanalysen zur Risikoeinschätzung in Mammakarzinomen (EndoPredict-Test bzw. Oncotype Dx Test)
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PCR- und Array-basierte Verfahren zum Nachweis von Viren, Bakterien, Pilzen und mögliche Resistenzen
PCR
In der PCR (Polymerase-Chain-Reaktion) kommt es durch die Taq-Polymerase und das Einsetzen spezifischer Primer zur exponentiellen Amplifikation gezielter Genabschnitte. Die Vervielfältigung der zu untersuchenden DNA ist Voraussetzung für weiterführende Detektionsverfahren. In einer Nested-PCR (geschaltete PCR) werden zwei PCR Reaktionen nacheinander geschaltet. Das erste PCR Endprodukt dient als Ausgang für die zweite PCR. Durch die Verwendung eines zweiten spezifischen Primers, der innerhalb des ersten PCR-Endproduktes bindet, wird das Verfahren sensitiver.
Real-time PCR
Die real-time PCR beschreibt eine quantitative Amplifikationsmethode für DNA. Die Quantifizierung erfolgt mit Hilfe von Fluoreszenzsonden, die mit der template-DNA interagiert. Die Amplifikation der DNA bewirkt die Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus in Echtzeit und ist letztendlich ein quantitativer Nachweis für das Vorkommen der Template-DNA.
Fragmentlänge (PCR)
Die negativ geladenen Nukleinsäuremoleküle wandern zur positiv geladenen Anode am Ende der Kartusche. Wie bei einer Agarosegelelektrophorese wandern die Moleküle mit niedriger Dichte schneller als Moleküle mit hoher Dichte. Während die Moleküle durch die Kapillare wandern, passieren sie einen Detektor, der das Fluorezenzsignal misst. Ein Photoelektronenvervielfacher wiederum konvertiert die gemessenen Lichtsignale in elektronische Daten um, die von der PC Software als Elektropherogramm oder Gelbild sichtbar werden.
Die jeweiligen PCR-Produkte werden in einer hochauflösenden Kapillarelektrophorese (ABI 3500 Genetic Analyzer) aufgetrennt, mittels Fluoreszenz detektiert und analysiert. Die ermittelten Fragmentlängen geben Aufschluss
Die Fragment-Längenbestimmung von PCR-Produkten kann mittels Kapillargelelektrophorese durchgeführt werden. Hierbei nutzt man die negative Ladung von den DNA-Fragmenten aus, da diese in einem quervernetzten Agarosegel zur positiv geladenen Anode wandern. Auf diese Weise können die PCR-Produkte visualisiert und mit bekannten Fragmentlängenmustern bestimmter Erkrankungen wie T-und B-Zell-Neoplasien oder Mikrosatelliteninstabilitäten verglichen werden.
NGS
Mittels NGS (Next Generation Sequencing) erfolgt die Sequenzierung von relevanten DNA- und RNA-Abschnitten. Im Vergleich zu anderen Sequenzierungsverfahren können mit NGS zahlreiche Genabschnitte simultan analysiert werden.
Termo Fisher
Die verwendete Ion Torrent™-Technologie basiert auf dem Prinzip eines pH-Meters. Jede in die Sequenz eingebaute Base (A, T, C, G) resultiert in einer Änderung des pH-Werts. Dadurch wird die chemisch codierte Information (A, C, G, T) direkt in digitale Informationen (0, 1) auf einem Halbleiterchip übersetzt.
Illumina (Prinzip des Sequencing-by-Synthesis)
Der Prozess identifiziert gleichzeitig DNA-Basen, während sie in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden. Jede Base sendet ein einzigartiges Fluoreszenzsignal aus, wenn es dem wachsenden Strang hinzugefügt wird, der zur Bestimmung der Reihenfolge der DNA-Sequenz verwendet wird.
Oder
Es wird die Synthese eines komplementären Stranges Nukleotid für Nukleotid verfolgt.
Dies ist möglich, da spezielle Nukleotide verwendet werden. Wird ein Nukleotid eingebaut, bricht die Synthese ab, da das Label die Polymerase blockiert.
MALDI-TOF
(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight) ist eine Methode zur Detektion von Sequenzveränderungen in DNA-Fragmenten die eine Alternative zur Sanger-Sequenzierung darstellt.
Zunächst werden die Hot Spot-Genregionen mittels PCR amplifiziert. Nach der Applikation einer spezifischen Matrix wird das auf einen Chip transferierte PCR-Produkt mit einem Laser beschossen. Die Moleküle werden ionisiert und in einem Vakuum beschleunigt. Die Flugzeiten der entstandenen Ionen werden gemessen und aufgrund der ermittelten Daten ein Spektrum der Masse-Ladungsverhältnisse erstellt. Dabei ist es möglich einzelne Basenunterschiede in der DNA anhand des Masse/Ladungsverhältnisses zu detektieren.
Sequenzierung
Sanger Seq.
Die sogenannte Kettenabbruchmethode ist eine von Frederick Sanger entwickelte Methode der Bestimmung der Basensequenz eines DNA-Abschnittes, wie z.B. eines PCR-Produktes (Polymerasekettenreaktion).
Bei dem auch als Didesoxy-Methode bezeichneten Verfahren wird ein mit Fluoreszenzfarbstoffen markierter komplementärer DNA-Strang in vitro synthetisiert, wobei die Verwendung sogenannter Didesoxynukleotide zu einem zufallsmäßigen Kettenabbruch und somit zu unterschiedlich langen DNA-Strängen führt.
Als Ausgangspunkt der Neusynthese dient ein sequenzspezifisches Startermolekül (PCR Primerliste siehe Anlage 35_9.14), der an die denaturierte, einzelsträngige DNA-Vorlage anbindet. Eine DNA-Polymerase synthetisiert in vier parallelen Reaktionen die Synthese eines komplementären Stranges, wobei neben den vier 2-Desoxyribonucleotidtriphosphaten (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) jeweils ein Didesoxytriphosphat (ddATP, ddTTP, ddCTP und ddGTP) zugefügt wird. Dieses wird wie die anderen eingebaut, jedoch kann die Kettenverlängerung aufgrund der fehlenden 3'-OH-Gruppe nicht erfolgen. Auf diese Weise erhält man ein Gemisch mit unterschiedlich langen DNA-Molekülen, an deren 3'-Ende sich stets eine bestimmte Didesoxy-Base befindet. Wurde dem Reaktionsgemisch z.B. ddATP beigemischt, enden alle Moleküle mit einem Adenin.
Durch die Verwendung unterschiedlich farbstoff-konjugierter Nukleotide können die vier Reaktionsansätze in einem einzigen Reaktionsgemisch ablaufen.
Die aus der Sequenzierungsreaktion resultierenden DNA Fragmente werden anschließend in einem Polymer mittels Kapillarelektrophorese in einem Sequenziergerät entsprechend ihrer Länge aufgetrennt, über einen Fluoreszenzdetektor analysiert und die Sequenz so Base für Base ermittelt werden.
Pyrosequenzierung
Die Pyrosequenzierung ist eine Variante der DNA-Sequenzierung, die auf der Detektion von freigesetzten Pyrophosphaten beim Einbau von Nukleotiden basiert.
Ähnlich der Sanger-Sequenzierung erfolgt bei der Pyrosequenzierung ebenfalls die Neusynthese eines komplementären DNA-Strangs, jedoch ohne Kettenabbruch durch Didesoxynukleotide.
Hybridisierungs Verfahren
ISH
Histochemisches Verfahren basierend auf Nucleinsäuren
--> einzelsträngige DNA oder RNA (=Ziel) und markierte komplementäre
Sonden binden an spezifischen DNA- oder RNA- Abschnitten und bilden einen spezifischen Komplex (=Hybrid)
Nachweis von spezifischen DNA- bzw. RNA-Sequenzen direkt auf dem histologischem Schnittpräparat „In-Situ“
Prinzip FISH
Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) dient zum Nachweis von Chromosomenaberrationen, Genamplifikationen und –Translokationen (spezifische Indikation siehe Leistungsspektrum).
Die Methode beruht auf der Hybridisierung von komplementären, fluoreszenzmarkierten DNA- Sonden in Zellkernen einzelner Zellen („in situ“). Durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzmarker können mehrere Zielstrukturen gleichzeitig detektiert werden.
Die Stärke der Methode liegt darin, dass sie es möglich macht, eine bestimmte genetische Aberration direkt der betroffenen Zelle zuzuordnen. Dadurch ist es möglich, z.B. bei Genamplifikation, einen Unterschied zwischen Tumor- und Normalgewebe zu detektieren.
Prinzip SISH
Silber in-situ- Hybridisierung dient zum Nachweis von spezifischen DNA- bzw. RNA-Sequenzen in-situ durch komplementäre Bindung von markierten Sonden (Nucleinsäure)
Detektion mittels Versilberung
Farbreaktion abh. vom gekoppelten Enzym (z.B. HRPO) und entsprechendem Substrat (H2O2)
LCD Array
In der PCR-Reaktion wird die Zielsequenz biotinyliert. Die biotinylierten PCR-Produkte hybridisieren mit spezifischen Capture-Proben auf dem jeweiligen LCD Chip. Der Nachweis erfolgt mittels eines Streptvidin-Enzymkomplexes. Die Färbereaktion wird mit Hilfe eines Slide-Scanners digitalisiert, dann ausgewertet und ein Report erstellt.
IHC = Immunhistochemie
In der Immunhistologie werden Antigene (meist Proteine) mit Hilfe von Antikörpern im Gewebeschnitt detektiert. Der Nachweis beruht auf der spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion. Der Antikörper ist mit einem Detektionssystem gekoppelt, der das Vorhandensein und die Lokalisation im Präparat sichtbar macht. In der Pathologie dient die Detektion zur Identifikation und Klassifizierung von Tumorzellen, die bestimmte Antigene exprimieren.
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